人体外周血dna提取与鉴定

一、为何选择外周血？

外周血因易获取且含大量白细胞（含细胞核DNA），成为DNA提取的理想样本。其应用覆盖肿瘤基因检测（如ctDNA分析）、亲子鉴定、遗传病诊断等领域。

二、DNA提取的核心原理

提取过程需突破三重屏障：

红细胞裂解：利用渗透压差异（如NH4Cl溶液）选择性裂解无核红细胞。

白细胞破碎：表面活性剂（如SDS）破坏细胞膜和核膜，释放DNA。

去杂质与沉淀：通过酚/氯仿抽提去除蛋白质，高盐乙醇沉淀DNA。

三、标准化操作流程

样本采集

使用EDTA抗凝管采集5ml静脉血，室温保存≤2小时，4℃不超过5小时。

避免溶血或凝血，否则影响DNA纯度。

红细胞裂解

加入红细胞裂解液（如ELS：NH4Cl+Tris缓冲液），离心去除碎片。

重复裂解直至沉淀呈乳白色（白细胞富集）。

DNA释放与纯化

裂解白细胞：SDS+蛋白酶K消化核蛋白。

去蛋白：酚/氯仿抽提后离心分层，保留上层含DNA水相。

沉淀DNA：加入冷乙醇/异丙醇析出DNA絮状物。

洗涤与保存

70%乙醇洗涤去除盐分，TE缓冲液溶解DNA，-20℃长期保存。

四、鉴定DNA质量的三大指标

浓度与纯度

紫外分光光度计检测：

A260/A280比值1.7-2.0表示高纯度（蛋白质污染少）。

浓度计算：DNA(μg/μL)=A260×50×稀释倍数。

完整性验证

琼脂糖凝胶电泳：清晰主条带（约23kb）表明DNA完整。

PCR扩增：特定基因片段成功扩增提示DNA可用性。

五、常用提取方法对比

方法优点缺点适用场景

酚/氯仿法高纯度，适用于Southern blot步骤繁琐，有毒试剂科研（需高质量DNA）

盐析法成本低，无需有机溶剂纯度略低常规PCR检测

磁珠法/试剂盒快速（1-2小时），高通量成本较高临床检验

六、关键注意事项

防污染：使用无菌环境、一次性耗材，避免外源DNA干扰。

防降解：操作轻柔减少机械剪切，添加EDTA抑制DNA酶。

试剂质量：定期检查裂解液pH值，避免酸性酚导致DNA损失。

七、实际应用场景

肿瘤诊断：检测ctDNA中的基因突变指导精准用药。

遗传病筛查：通过WES全外显子测序分析致病基因。

法医学：STR分型用于个体识别和亲子鉴定。

结语

外周血DNA提取与鉴定技术虽已成熟，仍需严格质控。随着自动化提取和测序技术的发展，该技术将在个性化医疗中发挥更大作用。未来，纳米孔测序等新技术或进一步简化流程，推动即时检测（POCT）的普及。