一、样本质量问题
采集不规范
使用未消毒的采血针或未按标准流程操作可能导致样本污染或溶血，释放血红蛋白等抑制物，干扰后续DNA提取。此外，抗凝剂选择不当（如肝素）会抑制DNA聚合酶活性，影响PCR扩增。
保存条件不当
血液样本在高温、光照或潮湿环境中保存会导致DNA降解。例如，全血在2-4℃储存超过2个月或反复冻冻融会显著降低DNA得率。
血浆中游离DNA（cfDNA）半衰期仅16分钟至2.5小时，若未及时处理或冷冻保存，DNA会快速降解。
二、DNA提取技术缺陷
裂解不充分
红细胞裂解不彻底或白细胞核裂解时间不足会导致DNA释放不完全。例如，血液样本量过多（如超过1ml）会超出试剂盒处理能力，需调整起始材料量。
洗脱条件不佳
洗脱缓冲液体积过大（如超过100μl）会稀释DNA浓度，建议减少洗脱液体积以提高浓度。
乙醇残留会抑制PCR反应，需延长干燥时间或增加洗涤步骤。
试剂选择与操作失误
低质量裂解液或未添加RNase A会导致RNA污染，降低A260/A280比值（正常范围1.7-2.0）。部分试剂需现配现用（如含乙醇的洗涤缓冲液），否则沉淀物析出影响纯度。
三、纯化与检测误差
杂质残留
蛋白质、多糖或抗凝剂（如EDTA）未彻底去除会与DNA共沉淀，降低纯度并抑制PCR。磁珠法提取时，磁性颗粒残留需通过高速离心去除。
检测方法局限性
血浆游离DNA含量极低（约7.35ng/mL），Nanodrop等紫外分光光度计在低浓度下误差大，可能出现假阴性。建议改用荧光定量（如Qubit）或直接进行PCR验证。
四、实验环境与操作者因素
交叉污染
实验器材或环境中的外源DNA（如气溶胶污染）会导致假阳性，需严格分区操作并定期紫外消毒。
操作经验不足
离心速度不当、未平衡离心管或未充分混匀试剂均会影响提取效率。例如，异丙醇沉淀DNA时需轻柔颠倒混匀，避免剧烈震荡导致DNA断裂。
五、解决方案与优化建议
样本处理
采集后立即分装冷冻（-70℃最佳），避免反复冻融。
使用EDTA或柠檬酸抗凝管，避免肝素污染。
技术优化
增加裂解时间至30-60分钟，或加入蛋白酶K提高裂解效率。
更换高灵敏度试剂盒，如磁珠法或硅胶膜吸附法。
验证与质控
电泳检测DNA完整性（主条带＞10kb），排除降解。
设置内参基因（如β-actin）验证PCR体系有效性。
六、特别说明：血清/血浆PCR浓度低的特殊性
血清中游离DNA浓度本身极低，且可能因疾病状态（如肿瘤、感染）或个体差异波动较大。若PCR无扩增，需排除以下因素：
抑制剂干扰：通过稀释模板或柱纯化去除酚、盐等。
引物设计问题：重新设计引物，优化退火温度及GC含量。
模板量不足：增加PCR循环次数（建议≤40）或采用巢式PCR提高灵敏度。
通过系统排查上述因素并优化实验流程，可显著提升人血DNA提取浓度及PCR成功率。若仍存在问题，建议结合多方法验证（如电泳、荧光定量、测序），避免单一检测手段的局限性。
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