1.什么是cDNA？
互补DNA（Complementary DNA，cDNA）是以信使RNA（mRNA）为模板，通过逆转录酶合成的单链或双链DNA。其序列与mRNA互补，可用于基因表达分析、文库构建等研究。
2.核心步骤详解
步骤一：提取mRNA
目的：从细胞或组织中分离高质量的mRNA作为模板。
关键操作：
破碎细胞，释放RNA。
使用硅胶柱、磁珠法或酚氯仿法纯化RNA，避免RNA酶（RNase）污染导致降解。
通过电泳或分光光度法检测RNA纯度。
步骤二：合成第一链cDNA
核心工具：逆转录酶（如SuperScript III），可将RNA逆转录为互补DNA链。
反应条件：
引物选择：常用寡聚dT引物（与mRNA的poly-A尾结合）或随机引物。
温度与时间：退火步骤通常在25°C下进行5分钟，逆转录反应在42–46°C下持续20–90分钟。
辅因子：需添加dNTPs（脱氧核苷酸）、Mg²⁺等以支持酶活性。
步骤三：合成第二链cDNA
目的：将单链cDNA转化为双链，提高稳定性和后续分析兼容性。
方法：
酶法合成：使用DNA聚合酶（如大肠杆菌DNA聚合酶I）以第一链为模板延伸。
自身引导法：单链cDNA的3’端形成发夹结构，直接作为引物引导第二链合成，无需额外引物。
处理模板：通过氢氧化钠或RNase H去除RNA模板，确保仅保留DNA。
步骤四：纯化与验证
纯化：去除未反应的dNTPs、酶和短片段DNA，常用酚/氯仿抽提或乙醇沉淀。
验证方法：
凝胶电泳：检测cDNA片段大小是否符合预期。
PCR扩增：验证目标基因是否成功合成。
步骤五：克隆与测序
克隆：将双链cDNA连接到质粒或噬菌体载体中，转化宿主细胞进行扩增。
测序：通过Sanger测序或高通量测序技术获取cDNA序列信息，用于后续功能研究。
3.关键注意事项
RNA稳定性：全程需避免RNase污染，使用抑制剂（如RNasin）。
酶的选择：不同逆转录酶对温度、模板复杂度有不同适应性。
质量控制：每步均需验证产物质量，避免逆转录不完全或杂质干扰。
4.应用与延伸
基因表达分析：通过qPCR或测序研究特定基因的表达水平。
cDNA文库构建：将cDNA克隆至载体，用于大规模基因筛选。
疾病研究：如分析胰岛素敏感细胞与耐药细胞的基因差异。
5.技术挑战与改进
长片段合成：超过3 kb的cDNA需延长反应时间至3–4小时。
高效方法：如CellSafe-HiSense试剂盒可在20分钟内完成第一链合成。
结语
体内合成cDNA是分子生物学研究的基础技术，其步骤虽复杂但高度标准化。通过优化RNA提取、酶反应条件和验证手段，可显着提升cDNA质量，为基因功能与调控研究奠定基础。
客服