一、引言
CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法是一种广泛应用于植物、真菌及环境样本的DNA提取技术。其核心原理是通过去污剂裂解细胞膜，结合高盐-低盐条件选择性沉淀DNA，并去除蛋白质、多糖等杂质。以下结合多篇文献，系统介绍CTAB法的标准化操作及科学依据。
二、实验原理
CTAB的作用：CTAB是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜和核膜，释放DNA。同时，它与核酸形成复合物，在高盐环境（如0.7 M NaCl）中保持可溶，而在低盐条件（如0.3 M NaCl）下沉淀，从而与杂质分离。
氯仿/异戊醇的作用：通过相分离去除蛋白质和脂质。氯仿使蛋白质变性，异戊醇减少气泡，提高分层效率。
乙醇沉淀：DNA在乙醇或异丙醇中因溶解度降低而沉淀，实现纯化。
三、所需试剂与器材
试剂：CTAB提取缓冲液（含Tris-HCl、EDTA、NaCl、CTAB）、β-巯基乙醇（抗氧化）、氯仿/异戊醇（24:1）、RNase A、异丙醇/乙醇、TE缓冲液等。
器材：液氮、研钵、离心机、水浴锅、移液器等。
四、详细操作步骤
样本预处理
植物叶片：取0.2–0.5 g幼嫩叶片，液氮速冻后研磨成细粉（防止DNA降解）。
菌丝或环境样本：剪碎后加入石英砂研磨，或剪碎滤膜。
细胞裂解
将粉末转移至离心管，加入预热的CTAB缓冲液（含2%β-巯基乙醇），65℃水浴30–60分钟，期间轻柔颠倒混匀（促进裂解）。
去除蛋白质与杂质
加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），轻柔混合至乳浊状，12,000 rpm离心10分钟。取上清液，避免吸入中间层杂质。
重复抽提1–2次以提高纯度。
DNA沉淀
上清液中加入0.1倍体积的NaAc（3 M）和0.6–1倍体积异丙醇/预冷乙醇，-20℃静置30分钟或过夜，12,000 rpm离心10分钟收集DNA沉淀。
洗涤与溶解
用70%乙醇洗涤沉淀2次（去除盐分），风干后溶于TE缓冲液或无菌水。
加入RNase A（终浓度10μg/mL）37℃处理30分钟，去除RNA。
保存
测定浓度（如分光光度法），-20℃或-80℃长期保存。
五、注意事项与优化
材料选择：优先使用幼嫩组织（如植物新叶），其细胞壁较薄且次生代谢物少，利于提取高纯度DNA。
防降解措施：全程保持低温（如液氮研磨、预冷试剂），避免DNase污染。
安全操作：氯仿和β-巯基乙醇有毒，需在通风橱中处理，佩戴防护装备。
优化方向：
多糖含量高的样本（如水果）可增加CTAB浓度或延长水浴时间。
若DNA难溶解，可适度延长TE缓冲液浸泡时间或调整pH。
六、应用场景
CTAB法在植物基因组学（如分子标记、PCR）、病原菌检测（如灰霉病菌DNA提取）及环境DNA监测中广泛应用。相较于SDS法，其在高多糖、多酚样本中表现更优。
七、总结
CTAB法通过化学裂解与相分离实现DNA高效提取，步骤标准化但需根据样本特性微调。掌握原理与细节后，可灵活应用于科研、农业及环境监测领域。
客服