1.纯度检测:识别杂质干扰
DNA纯度直接影响后续实验(如PCR、测序)的成败。常用方法包括:
紫外分光光度法:通过260nm(DNA吸收峰)与280nm(蛋白质吸收峰)的吸光度比值(A260/A280)评估纯度。理想比值为1.8-2.0,低于1.8表明存在蛋白质污染,需重新纯化。
荧光定量法:使用荧光染料(如PicoGreen)特异性结合DNA,避免蛋白质或RNA的干扰,适合微量样本。
2.浓度测定:确保足量DNA
DNA浓度不足可能导致扩增失败,过高则可能抑制反应。
荧光定量法:高精度测定DNA浓度,尤其适用于法医微量样本(如烟头、指纹残留物)。
紫外分光光度法:快速估算浓度(A260值为1对应约50μg/mL双链DNA),但易受杂质影响。
3.完整性评估:验证DNA结构
DNA链的完整性对长片段扩增(如全基因组测序)至关重要。
琼脂糖凝胶电泳:通过电泳条带判断DNA片段大小。完整基因组DNA应显示单一高分子量条带;若出现拖尾或弥散,提示降解。
微流控芯片分析:自动化检测DNA片段分布,适用于高通量实验室。
4.污染控制:杜绝交叉污染
污染可能导致假阳性或假阴性结果,需严格管控:
空白对照设置:提取过程中加入不含DNA的空白样本,监测试剂或操作污染。
分区分时操作:将样本处理、PCR扩增和测序区域物理隔离,避免气溶胶污染。
重复实验验证:对关键样本(如法医物证)进行多次提取和扩增,确保结果一致性。
5.功能性验证:确认DNA可用性
纯度、浓度达标后,需通过实际应用验证DNA功能:
PCR扩增:针对目标区域(如STR位点)进行扩增,检测是否成功。失败可能提示抑制剂残留或DNA降解。
测序分析:通过二代测序(NGS)直接读取碱基序列,验证DNA模板质量,精度需达99.99%。
6.特殊样本的额外要求
微量/降解样本:需增加扩增循环数或采用全基因组扩增技术。
古DNA样本:需检测天冬氨酸外消旋化率以评估保存状态,并使用超净工作台防止外源污染。
总结
DNA提取后的鉴定标准是科学研究的“质量门控”,涉及理化性质检测、污染防控及功能性验证。这些标准在法医学、亲子鉴定和古DNA研究中尤为重要,确保结果的可信度与可重复性。随着技术进步(如单分子测序),鉴定方法将更趋精准,但严谨的标准化操作始终是科学真相的基石。